Citogenetska analiza

 

Šta je proučavanje citogenetskih analiza?

Citogenetska analiza (kariotip ili hromozomski ili karta) je proučavanje hromozoma ćelija. Hromozomi sadrže gene koji su sastavljene od DNK, molekul koji sadrži sve neophodne informacije za izgradnju određenog pojedinca i funkcionisanje organizma.

U ljudskom telu imamo 46 hromozoma, 23 hromozoma dolaze od oca (sperme) i 23 od majke (jajne ćelije). Sperme i jajne ćelije su ćelije zametka i jedini su koji sadrže samo 23 hromozoma. Ako je sperma onda nosi X hromozom, i žensko dete će se roditi, dok ako se nosi Y hromozom, muškarac će se roditi. Kariotip normalne ženske će tada biti 46, XX dok je u muškom 46, XY. Da se prouče hromozomi moramo da koristimo tehniku kulture tokom ćelijske deobe da ih vidimo.

 

Koja je korist od citogenetskih analiza?

Citogenetske analize za ispitivanje da li postoje promene u broju  i/ili strukture hromozoma koji mogu biti odgovorne za bolesti kao što su Daunov sindrom, neplodnost/sterilnosti (npr. Turner i Klinefelter sindrom), psihomotorni i jezični sindrom, rasta i razvoja. Čak je i rani abortus može biti rezultat hromozomske greške u jednom od roditelja (3-5% slučajeva).

 

Kada treba da se radi citogenetska analiza?

• Prenatalna citogenetika se vrši u trudnoći kod kojih postoji povećan rizik od hromozomskih anomalija kod fetusa, starosti majke jednak ili veći od 35 godina (završen pre rođenja deteta), zbir pogrešnog broja hromozoma, roditelji nose strukturne preraspodele i promene koje ne pokazuju kliničke znakove, roditelji sa brojnom greškom seks hromozoma (npr 47, XXX, 47, XXY), defekti istaknute tokom ultrazvučnog pregleda, indikacije koje proizilaze iz biohemijskih testova (npr bi-test), rekurentni pobačaji. Uzimanjem uzorka horionskih čupica transabdominalnim putem se može obaviti tokom prvog tromesečja (9-12 nedelja) ili amniocenteza tokom drugog tromesečja (15-18 nedelja). CVS ćelije se uzimaju iz placente (horionske čupice) koji imaju isto poreklo (i stoga isti genetski) kao fetalni dok je amniocenteza za proučavanje fetalnih ćelija u plodove vode (amniocenteza).

• Citogenetska analiza posle porođaja. Kariotipizacija se izvodi kod pacijenata gde se sumnja na hromozomske sindrome, roditelji i članovi porodica kod onih sa hromozomopatijama, roditelji neispravanog ili subjekti sa sumnjom na hromozomske sindrome koji su umrli bez dijagnoze, gde postoji mentalna retardacija i/ili defekti pri rođenju, retardacija, kod dece rođena ili mrtav, parovi sa rekurentnim pobačajima, muška neplodnost, žene sa primarnom ili sekundarnom amenorejom (odsutnost ili prekid menstrualnog ciklusa).

• Citogenetika abortusnog materijala. Oko 15-20% svih priznatih trudnoća dovodi do pobačaja i više od 50% imaju izmenjen broj i/ili strukturu hromozoma zbog kojeg je došlo do prekida trudnoće. Citogenetska ispitivanja tkiva abortifacijentisa je stoga od suštinskog značaja za razumevanje uzroka prekida trudnoće, i da se podrži par (u većini slučajeva hromozomska greška je čisto slučajna i ne podrazumeva povećan rizik ponavljanja ovog događaja).

• Citogenetika tumora. Citogenetska analiza se takođe može obavljati za proučavanje tumore, i hematološke (npr leukemije) i čvrste supstance (npr pluća, dojke, jetre, bešike). Određena hromozomska preuređivanja su tumor specifični i samim tim omogućiti tačnu dijagnozu u poređenju sa kliničkom sumnjom ili sumnje. Na primer, pronalazak Philadelphia hromozoma u koštanoj srži aspirata iz pacijenta za kojeg se sumnja da ima leukemiju, koristi se za dijagnostikovanje hronične mijeloidne leukemije, ili prisustvo T (X; 18) u ćelijskoj kulturi pripremljena iz biopsije čvrstog tumora i dozvoljava da dođemo do dijagnoze sinovijalnog sarkoma.

 

Nove tehnologije: Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)

Razvoj sofisticiranih tehnika definisana u molekularnoj citogenetici, kao što su fluorescentna in situ hibridizacija (FISH), omogućava nam da izvršimo detaljnije citogenetičke studije jer omogućava lokaciju specifične sekvence DNK-a na fiksnim pripremama hromozoma, interfaze jezgra i sekcije tkiva, dobijene od bilo koje vrste biološkog materijala (krv, biopsija, amnionske tečnosti, polnih ćelija), bilo da je svež, krioprezerviran ili parafin. Tehnika FISH se zasniva na osobinama DNK denaturacije na reverzibilan način (otvaranje dvostrukog heliksa) i obezbeđuje vezu između određenog DNK fragmenta do regiona od interesa – obeleženog sa fluorescentnim jedinjenjima (sonda) – i priprema komplementarne DNK sekvence koja se montira na mikroskop: hromozomska oblast od interesa je tako lako identifikovati sa fluorescentnim mikroskopom.

FISH je nezamenljiv dodatak tradicionalnoj citogenetici kao što karakteriše veću snagu rezolucije, što omogućava da se okarakterišu hromozomske abnormalnosti u broju i strukturi, koji ne može definisati kroz tehnikama klasične citogenetike i identifikovali tajanstvene preraspodele, koja nisu vidljiva čak i nakon bendinga visoke rezolucije. FISH se ne primenjuje na rutinske analize kariotipa nego samo u pojedinim slučajevima na osnovu specifičnih dijagnostičkih sumnji ili da prodube neke citogenetičke abnormalnosti.

Jedan od najnovijih aplikacija je u oblasti onkologije: u mnogim slučajevima, u stvari, naročito za solidne tumore, koji ne dobijaju rast i deobu ćelija i na taj način ne mogu da ukažu na hromozome i analizirati ih. Pored toga, nivo rezolucija studija sa tradicionalnom citogenetikom ne dozvoljava nam da se identifikuju abnormalnosti koje mogu da se odnose na samo jednog gena.

Od 2000. razvijeni su DNK sonde u stanju da prepoznaju specifične abnormalnosti, od raka mokraćne bešike primer za koje se koriste četiri sonde koje prepoznaju hromozome 3, 7, 17:09 označene sa različitim fluorohromima (Multibojni FISH).

Citogenetska laboratorija kliničkog instituta Humanitas je referentni centar za proučavanje raka mokraćne bešike. Nakon istraživanja koje je sprovedeno testiranje efikasnosti ovog testa, uveden UROVISION® analiza u kliničkoj praksi u saradnji sa jedinicom za urologiju. Test je neinvazivna i omogućava detekciju u 48 sati, putem tumorskih ćelija dobijenih iz jednostavnog uzorka urina. Test ima visoku prediktivnu moć, što znači da FISH identifikuje hromozomopatije tipične za rak pre nego postoje dokazi o bolesti ili pozitivna cistoskopska istraživanja drugih dijagnostičkih markera kao što su CTM (maligne ćelije tumora). U 2001. godini, test je odobren od strane Food and Drug Administration (FDA) za praćenje recidiva bolesti kod pacijenata koji su već dijagnostikovani sa rakom i bili podvrgnuti operaciji za uklanjanje i/ili BCG terapiju, i u 2004. godini za dijagnostiku kod pacijenata sa hematurijom.

Ova FISH tehnika takođe može da pruži informacije o najprikladnijim terapijama za određene vrste raka u pojedinačnom pacijentu (ciljana terapija). Poznato je, na primer, da pacijenti sa kancerom dojke koji imaju pozitivan FISH za amplifikaciju gena pod nazivom HER-2/neu, čiji proteini se eksponiraju na ćelijskoj membrani tumora, odgovoriti na terapiju sa određenom drogom, trastuzumab, antitelo koje se vezuje za receptor za neutralisanje (imunoterapija). Test se zove PATHVISION® i odobren je od strane FDA. FISH se takođe može koristiti za proučavanje amplifikacije drugog genusa pod nazivom EGFR kod raka pluća i debelog creva. I u ovom slučaju možete koristiti različite lekove u zavisnosti da li je tumor pacijenta se potvrđen ili ne, u zavisnosti od amplifikacije gena. U ovim slučajevima nije terapija koja koristi antitela ali mali molekuli koji inhibiraju deobu ćelija (biološka terapija).

Nove granice su se otvorile sa primenom FISHAa za druge vrsta raka, kao što je melanom, gde je diferencijalna dijagnoza displazičnog nevusa naročito teška ako se zasniva isključivo na morfološke kriterijume.

Zbog velike osetljivosti, specifičnosti i očekivajuće snage, tehnika FISH je posebna efikasna u proučavanju kako hematoloških, tako i solidnih tumora. Posebno, ne samo da je dijagnostičko/prognostički ali je bitan u izboru terapije na osnovu genomskog profila tumora.