Šta predstavlja citogenetska analiza?
Citogenetska analiza (kariotip ili hromozomska mapa) jeste izučavanje ćelijskih hromozoma. Hromozomi sadrže gene koji se sastoje od DNK, molekula koji sadrži sve potrebne informacije za za stvaranje i razvoj jedinke i funkcionisanje organizma.
U ljudskoj ćeliji postoji 46 hromozoma, 23 hromozoma nasleđuju se od oca (spermatozoid) i 23 od majke (jajna ćelija). Spermatozoid i jajna ćelija su polne ćelije i jedine su koje sadrže samo 23 hromozoma. Ukoliko spermatozoid nosi X hromozom, rodiće se devojčica, a ukoliko nosi Y hromozom rodiće se dečak. Kariotip normalne ženske jedinke biće onda 46, XX, dok će kod muške jedinke biti 46, XY. Kako bismo proučavali hromzome moramo da koristimo tehniku uzgajanja tokom ćelijske deobe kako bismo ih mogli videti.
Koja je korist citogenetske analize?
Citogenetska analiza koristi se za utvrđivanje da li postoje promene u broju i/ili strukturi hromozoma koji mogu biti odgovorni za nastanak oboljenja poput Daunovog sindroma, neplodnosti, (npr. Tarnerov i Klinefelterov sindrom), psihomotornog i jezičkog sindroma, nepravilnog rasta i razvoja. Čak i postojanje ranog spontanog pobačaja može biti ukazatelj hromozonske greške kod jednog od roditelja (3-5% slučajeva).
Zašto bi se neko podvrgao citogenetskoj analizi?
- Prenatalna citogenetska analiza primenjuje se kod trudnoća za koje je utvrđeno da postoji povećan rizik od hromozomskih aberacija fetusa, kod trudnoća gde je majka starija od 35 godina (napunjenih pre rođenja deteta), kod zbira nepravilnog broja hromozoma, roditeljia sa genom koji nose poremećaje ali koji nisu klinički ispoljeni, roditelja sa nepravilnim brojem polnih hromozoma (npr. 47, XXX; 47, XXY), defekata na rođenju koji su utvrđeni preko ultrazvučnog pregleda, indikacija koje su utvrđene biohemijskim testovima (npr. bi-test), kod ponovljenih spontanih pobačaja. Uzima se uzorak transabdominalnih horionskih resica (CVS test) može da se izvede tokom prvog tromesečja (9-12. nedelja trudnoće) ili amniocenteza tokom drugog tromesečja (15-18. nedelja). Kod CVS testa ćelije koje se uzimaju za analizu istog su porekla (pa samim tim i istog genetskog sastava) kao i plod, dok se kod amniocenteze za analizu uzimaju ćelije ploda koje se nalaze u plodovoj vodi.
- Postnatalna citogenetika. Određivanje kariotipa obavlja se kod pacijenata za koje se sumnja da imaju neki od hromozomskih sindroma, kada neko od roditelja ili članova porodice ima neke hromozomske aberacije, roditelja sa malformacijama, lica za koje se sumnja da imaju neki hromozomski sindrom a koja su umrla bez uspostavljene dijagnoze, u slučajevima zaostalosti u razvoju i/ili urođenih defekata, retardacije, kod mrtvorođene dece, kod parova sa ponavljanim spontanim pobačajima, kod muške neplodnosti, žena sa primarnom ili sekundarnom amenorejom (nepostojanje ili prekidi menstrualnog ciklusa).
- Citogenetika materijala od abortusa. Približno 15-20% svih registrovanih trudnoća završi se spontanim pobačajem i više od 50% njih imale su izmenjen broj i/ili strukturu hromozoma zbog čega je i došlo do prekida trudnoće. Citogenetsko ispitivanje tkiva nakon abortusa je od suštinske važnosti kako bi se utvrdio uzrok prekida trudnoće, i kako bi se datom paru pružila podrška (budući da je u većini slučaja hromozomska greška slučajna i ne nosi povećan rizik da će do toga ponovo doći).
- Citogenetika tumora. Citogenetska analiza takođe može da se sprovede kako bi se izučavali tumori, kako hematološki (leukemija) tako i organski (pluća, dojka, jetra, bešika). Izvensne promene na hromozomima su specifične za određene tumore tako da omogućavaju tačnu dijagnozu u odnosu na kliničku sumnju ili nejasnoću. Na primer, pronalazak Filadelfija hromozoma u uzorku koštane srži kod pacijenta za koga se sumnja da ima leukemiju, koristi se za dijagnozu hronične mijeloidne leukemije, ili prisustvo t (X; 18) u kulturi ćelije dobijene biopsijom čvrstog tumora omogućava dijagnozu Sinovijalnog sarkoma.
Nove tehnike: Fluorescentna in situ Hibridizacija (FISH)
Razvoj sofisticiranih tehnika u molekularnoj citogenetici, poput Fluorescentne In Situ Hibridizacije (FISH), omogućava nam da obavimo mnogo detaljnija citogenetska istraživanja jer nam omogućava lokacije određene sekvence DNK na fiksnim preparacijama hromozoma, interfaznim jezgrima i tkivima, dobijenim od bilo kog tipa biološkog materijala (krv, uzorak dobijen biopsijom, amnionska tečnost, polne ćelije), bilo je on u svežem stanju, čuvan na hladnom ili u parafinu. FISH tehnika bazira se na svojstvima denaturisane DNK na obrnut način (otvaranjem dvostrukog heliksa) i omogućava vezu između određenog segmenta DNK sa interesnim područjem – markiranog fluorescentim jedinjenjima (markeri) – i preparacije komplementarnog DNK segmenta fiksirane za mikroskopsku pločicu: hromozomski deo od interesa se tako lako identifikuje uz pomoć fluorescentnog mikroskopa.
FISH je nezamenljivi dodatak tradicionalnoj citogenetici budući da ga karakteriše bolja rezolucija, čime se omogućava prepoznavanje hromozomskih aberacija u broju i strukturi, koje se inače ne mogu ustanoviti tehnikama klasične citogenetike, kao i otkrivanje kriptičnih (skrivenih) promena na hromozomima koje nisu vidljive čak ni mikroskopima veće rezolucije. FISH tehnika se ne primenjuje kod A rutinske analize kariotipa, već samo u određenim slučajevima kod nejasne dijagnostike ili kako bi se produbila saznanja o postojećim citogenetskim nepravilnostima.
Jedna od najnovijih primena ove tehnike je u onkologiji: u mnogim slučajevima, tačnije, naročito kod uzoraka čvrstih tumora gde nema rasta ćelija i njihove podela pa se samim tim ne mogu izdvojiti hromozomi za analizu. Osim toga, nivo rezolucije kod primene tradicionalne citogenetike ne dozvoljava nam da identifikuje nepravilnosti koje se vezuju za samo jedan gen.
Od 2000. godine razvijeni su određeni DNK testovi kojima je moguće prepoznati određenu abnormalnost, na primer rak mokraćne bešike za koga se koriste 4 testa koja prepoznaju hromozome 3, 7, 17:09 označene različitim fluorohromima (Multicolor FISH) .
Citogenetska laboratorija Kliničkog instituta Humanitas je referentni centar za istraživanje raka mokraćne bešike. Nakon što je izvedena studija kako bi se potvrdila efikasnost testa, UROVYSION® analiza uvedena je u kliničku praksu u saradnju sa Odeljenjem za Urologiju. Test je neinvazivan i daje rezultate u roku od 48 sati, preko ćelija tumora koje se dobijaju iz jednostavnog uzorka urina. Test ima veliku moć predviđanja, što znači da FISH određuje hromozomske abnormalnosti tipične za rak mokraćne bešike pre nego što se sama bolest pojavi ili pre nego što se dobiju pozitivni rezultati citoskopije ili drugih dijagnostičkih markera poput CTM (maligne tumorne ćelije). U 2001. godini, test je odobren od strane Službe za hranu i lekove (FDA) za praćenje učestalosti bolesti kod pacijenata kod kojih je već bio dijagnostikovan rak i koji su bili podvrgnuti hirurškom zahvatu uklanjanja tumora i/ili BCG terapiji, a u 2004. godini za dijagnozu kod pacijenata sa hematurijom.
FISH tehnika takođe pruža informacije o najboljoj terapiji za određenu vrstu raka kod datog pacijenta (Ciljana Terapija). Poznato je na primer da pacijenti sa rakom dojkei pozitivnim FISH testom za amplifikaciju gena HER-2 / neu, čiji protein je izložen na zidu ćelijske membrane tumora, odgovaraju na terapiju određenim lekom, trastuzumab, antitelom koje se vezuje za receptor neutralizujući imunoterapiju. Test se naziva PATHVYSION® i odobren je od strane FDA. FISH takođe može da se koristu kao test za amplifikaciju još jednog gena zvanog EGFR i to kod raka pluća i debelog creva. I u ovom slučajevu mogu da se koriste određeni lekovi zavisno od toga da li je kod pacijenta pronađen tumor, zavisno od amplifikacije gena. U ovim slučajevima terapija se ne zasniva na primeni antitela nego na sitnim molekulima koji sprečavaju ćelijsku deobu (biološka terapija).
Upotrebom FISH testa postavljene su nove granice i za druge vrste karcinoma poput melanoma, gde je posebno teška diferencijalna dijagnoza displastičnog nevusa ukoliko se ona zasniva samo na morfološkim kriterijumima.
Zbog visoke osetljivosti, specifičnosti i anticipatorskoj snazi, FISH tehnika je posebno efikasna u istraživanju hematoloških i solidnih tumora. Posebno što ona nije korisna samo u dijagnostičke/prognostičke svrhe, već zato što je od suštinskog značaja u izboru terapije zasnovane na genomskom profilu tumora.
